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    赛车7码滚雪球公式计划:氟喹诺酮类药物体外抗ASFV活性研究

    北京pk10八码死公式 www.rtt80.com 作者:徐伟超 译来源:回盛生物 猪病研究院时间:2019-03-07 15:13点击:

    摘要:

    非洲猪瘟是重要的猪传染性疾病,目前尚无针对非洲猪瘟的有效疫苗,也没有合适的处置措施。本研究发现氟喹诺酮类药物具有抗非洲猪瘟的活性。当将非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)早期感染的vero细胞暴露于6种不同的氟喹诺酮类药物或他们的组合时,可以发现ASFV所导致的vero细胞的病变效应大幅的下降。此外,经过7天的药物处理,甚至无法通过PCR手段检出ASFV的核酸,而且培养液的上清不能感染新的细胞培养物。脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析发现经氟喹诺酮类药物处理后,细胞中病毒DNA的量有所下降,但是并未检测到病毒基因组碎片。在平行组中还发现病毒早期蛋白合成模式有所变化。本研究试验结果说明,细菌的拓扑异构酶抑制剂可能通过抑制假定的ASFV的2型拓扑异构酶来抑制ASFV的复制,这一研究结果为非洲猪瘟的治疗开辟了新的路径。

    1. 简介

    非洲猪瘟是一种严重威胁养猪业的疾病。非洲猪瘟在撒哈拉以南非洲国家是一种地方性流行病,该病于2007年又经格鲁吉亚传入欧洲大陆。从那时起,非洲猪瘟就不断的传播至邻近的国家或地区,从而彻底的改变了欧洲的非洲猪瘟形势。除了已感染非洲猪瘟的国家和地区以外,其他欧盟国家因与感染非瘟的国家地理位置较近的缘故,所以也是非瘟高风险地带。俄罗斯联邦及其周边地区非洲猪瘟由于缺乏统一的控制方案,大量的没有生物安全意识的散养户的存在,以及用泔水喂猪的方式,导致了对非洲猪瘟的控制困难重重。

    在这种形势下,欧盟的非洲猪瘟也时刻存在着传入东欧的风险,尤其是通过一些较难控制的途径,比如野猪的迁移、动物或动物产品的非法调运、受污染的传播媒介等。尽管已经投入了大量的时间和精力,但目前仍然没有研制出一种可以控制非洲猪瘟的疫苗产品,而且非洲猪瘟的控制需要做到早期诊断和极为严格的生物安全措施,所以非洲猪瘟往往会给感染的国家带来很大的经济损失和社会危害。

    非洲猪瘟的病原非洲猪瘟病毒是一种大DNA病毒,是非洲猪瘟病毒科的唯一一个成员。非洲猪瘟病毒可以编码2型拓扑异构酶(ASFV-TopoII),这一点相比于其他可感染哺乳动物的病毒而言是十分独特的。进化树分析表明,ASFV-TopoII与宿主细胞的TopoII不在同一进化分支,并且还与细菌DNA回旋酶和4型拓扑异构酶有25%区域完全一致,由此人们想到通过细菌的拓扑异构酶抑制剂(如氟喹诺酮类)来干扰ASFV的复制。

    氟喹诺酮类药物具有抗菌活性,因为氟喹诺酮类药物可以与细菌DNA回旋酶和4型拓扑异构酶形成药-酶-DNA裂解复合物,从而干扰DNA的复制和促发细胞死亡(如氧化应激和基因组断裂)。DNA回旋酶在DNA解链中发挥很大的作用,而4型拓扑异构酶在基因组分解过程中发挥很大的作用。

    近期的研究发现氟喹诺酮类药物分子结构所起的化学修饰作用是其“非典型”的抗病毒(RNA病毒或者DNA病毒)作用的物质基础??悸堑紸SFV可以编码2型拓扑异构酶,我们要通过试验来分析这些抗生素是否对ASFV的DNA复制和蛋白质合成有抑制活性,本试验用到的病毒株为Ba71V毒株,用到的培养细胞为Vero细胞。由于现在还没有合适的非洲猪瘟疫苗以及有效的防控措施,如果能发现一种有效的抗病毒药物,再将这种药物用于非洲猪瘟的防控,那么对于预防非洲猪瘟的扩散必将发挥很大的作用,也可以为政府机构采取干预措施赢得时间。

    2. 材料和方法(略)

    3. 结果

    3.1  感染了ASFV的Vero细胞培养于含特定氟喹诺酮类药物培养基中,ASFV的细胞病变减轻

    ASFV在感染进程中会伴随有明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、细胞凋亡和细胞死亡,本研究最开始评估30种氟喹诺酮类药物的抗病毒性质时,就是参考的Vero细胞的CPE这一指标。一部分氟喹诺酮类药物(恩诺沙星、格帕沙星、巴洛沙星、托氟沙星、加替沙星和加洛沙星)被证实在100μg/ml浓度时有抗病毒效应。被感染过的培养物在4小时后暴露于这些药物7d时间后,其CPE会变小甚至消失,当在感染后72小时与未经处理的ASFV感染的Vero细胞作比较的时候,会发现经药物处理组细胞接近于正常未感染的细胞。处理组感染ASFV的细胞会见到核碎裂所致细胞起泡,而不是典型的CPE现象。经药物处理组大部分的细胞单层保持着典型的纤维素样形态,而未经处理的细胞则表现出清晰的CPE现象,其质/核比例因此下降,如图1a和图1b。

    图1:药物处理组与非药物处理组细胞形态对比

    3.2  经氟喹诺酮类药物培养后,ASFV的感染性下降

    为了评估氟喹诺酮类药物对ASFV感染性的抑制,本研究测定了经药物7天处理后病毒DNA的含量情况。结果发现用经选择的药物(100μg/ml)处理后,病毒DNA含量发生了很大的下降,有的甚至检测不出DNA了。某些抗生素的抗ASFV作用还会显示出剂量依赖效应,随着抗生素浓度的增大(50μg/ml,75μg/ml和100μg/ml),DNA的含量逐步变少(图2A,条带 3~29)。此外,一些氟喹诺酮类药物的组合也具有很好的抑制ASFV的作用(2药物组合:25+25μg/ml和50+50μg/ml,3药物组合:15+15+15μg/ml和25+25+25μg/ml,图2A,32~57)。经上述药物或者药物组合作用7天后,ASFV感染的Vero细胞上清液检不到ASFV的DNA,而且该上清液也不能感染新的细胞培养物(图2B, 条带5,11, 14, 17, 23和26)。表1总结了能完全抑制ASFV核酸生成的药物或者药物组合。

    图2:各试验组跑胶结果

    3.3 氟喹诺酮类药物抑制ASFV的复制,但不形成基因组碎片

    氟喹诺酮类药物杀菌机制是药物可以和细菌核酸和拓扑异构酶形成DNA-拓扑异构酶-药物解离复合物,使得细菌基因组碎片化。因此,我们为了探明氟喹诺酮类药物抗ASFV的机制与杀菌机制是否一样,特别进行本试验来看看解离复合物是否存在,从而判断二者作用机制是否一致。和预计的情形一样,随着ASFV感染滴度的增加,无论完整的还是不完整的病毒核酸的量都会增加(图3,条带4~6),而经过药物处理后,无论完整的基因组核酸还是不完整的基因组核酸的量都有所下降(图3),当抗生素的浓度为100μg/ml时,这种减少就更为显著了(图3,条带12~14),阴性对照组未检测到病毒核酸条带(图3,条带1和2)。此外,ASFV感染的细胞经依托泊苷(宿主细胞特异性的2型拓扑异构酶抑制剂)作用后,未见基因组碎片种类的增加,这表明宿主的2型拓扑异构酶未受到影响(图3,条带3)。本研究也未检测到宿主细胞的基因组碎片,这说明氟喹诺酮类药物对宿主细胞没有产生影响,这与后续的MTS细胞毒性测定试验的结果是一致的。

    图3:各个试验组电泳图

    表1:能完全抑制ASFV核酸生成的药物或者药物组合

    3.4 氟喹诺酮类药物调节ASFV蛋白的合成

    本研究通过Western blot技术对比了感染了ASFV的Vero细胞在经氟喹诺酮类药物处理和未经处理的情况下病毒蛋白的合成情况。在感染的早期(6hpi),经氟喹诺酮类药物处理组的培养物其病毒蛋白的表达(图4A, 条带3~14)与未经药物处理组的是不同的(图4A, 条带2),其中两种病毒蛋白(~63kDa和~20kDa)经可在药物处理组见到,而一个小病毒蛋白(~17kDa)只能在未经药物处理组见到。

    在病毒感染的晚期(32hpi),就只能在未经药物处理组检出大于50kDa的病毒蛋白了(图4B, 条带2),而药物处理组仍能检出高水平的~35kDa的病毒蛋白和~17kDa的病毒蛋白(图4B, 条带3~14)。

    图4:各试验组Western blot结果

    3.5 氟喹诺酮类药物,在抗病毒浓度下,显示出低细胞毒性

    经过7天的药物处理后,6种效果较好的氟喹诺酮类药物会对细胞生长产生抑制作用,本研究通过MTS试验评估了药物在100μg/ml浓度下对细胞生长的抑制作用。结果显示抑制率从恩诺沙星的15%到巴洛沙星的40%不等(图5)。而所有2药物组合和3药物组合相比于使用单药都显示出很低的细胞生长抑制作用。

    图5:各种药物或者药物组合对细胞生长活性的抑制

    4. 讨论

    非洲猪瘟病毒科,藻类去氧核糖核酸病毒科和虹膜病毒科是目前所知的病毒科中仅有的可感染真核细胞还可以编码2型拓扑异构酶的病毒科。由于2型拓扑异构酶在病毒DNA的复制中发挥着很大的作用,而氟喹诺酮类药物又是该酶特定的抑制剂,所以用氟喹诺酮类药物抑制病毒的复制就成为了一种新的治疗选择。前文提到细菌DNA回旋酶/4型拓扑异构酶和ASFV的2型拓扑异构酶有一定的序列相似度,为此,本研究评估了30种用作抗生素的拓扑异构酶抑制剂对ASFV是否有抑制作用。

    研究的结果显示,恩诺沙星、格帕沙星、巴洛沙星、托氟沙星、加替沙星和加洛沙星可减轻ASFV感染Vero细胞的CPE,免疫组化分析发现经药物处理感染细胞在12hpi仍保持着细胞正常的多面体形状,这都说明ASFV的复制受到了药物的干扰。此外,上文提到的6种氟喹诺酮类抗生素以100μg/ml浓度使用7天后使得ASFV的核酸完全检测不到了,一些药物组合(25+25μg/ml或15+15+15μg/ml)也可以达到这种效果,且经药物作用的培养液上清不能够感染新的细胞培养物了。上述结果表明一些氟喹诺酮类抗生素对ASFV的繁殖的确有抑制作用,不过完全的抑制只发生在感染后早期使用这些抗生素后,这表明ASFV的拓扑异构酶可能在病毒感染的早期发挥较大作用。

    氟喹诺酮类抗生素通过与细菌DNA回旋酶/4型拓扑异构酶以及细菌DNA结合形成药-酶-DNA复合物,导致细菌基因组碎片化,进而抑制细菌DNA和RNA的复制和蛋白质的合成,致细菌快速死亡。本研究通过PFEG技术发现经药物处理后,病毒的完整核酸或者不完整的核酸都减少了,但是病毒DNA碎片并未检测到。合理的解释就是要么氟喹诺酮类药物对ASFV的作用机制与对细菌的不同,要么就是PFEG技术尚有不足。有其他研究人员已经指出,PFEG技术能检测到从很小的DNA片段到250kb的DNA片段。鉴于氟喹诺酮类药物能导致细菌形成很大的染色体碎片,再结合本试验的结果,可知该药物对ASFV的抑制作用与形成染色体片段是无关的。据此我们大胆推测,氟喹诺酮类药物应是ASFV的2型拓扑异构酶的可逆的抑制剂,这与其对细菌的作用是不同的。

    还需关注的一点,当ASFV感染的细胞培养物用依托泊苷处理后,并未见到ASFV基因的减少和病毒片段的增多。这说明宿主的2型拓扑异构酶并不切割病毒基因组,ASFV也并不需要宿主的这个酶。在病毒蛋白合成方面,免疫组化分析表明,无论在6hpi还是32hpi,经过药物处理和未经药物处理的ASFV感染的培养物在蛋白表达上有显著的差别。

    在缺乏有效疫苗的情况下,对非洲猪瘟的防控只能寄希望于严格的生物安全措施。而抗病毒药物的使用,可以使得非洲猪瘟的防控更加快捷高效,本研究正是希望找到这样一种抗病毒药物。

    本研究发现了6种氟喹诺酮类药物能有效的抑制非洲猪瘟病毒生长。因此,这些药物可以作为潜在的抗ASFV的工具。不过未来还需开展体内研究方能进一步证明其有效性。

    文章来源:Mottola, C., F. B. Freitas, M. Simoes, C. Martins, A. Leitao and F. Ferreira (2013). "In vitro antiviral activity of fluoroquinolones against African swine fever virus." Vet Microbiol 165(1-2): 86-94.

    责任编辑:尚晓雅  

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